Introducción: La utilización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, siglas en inglés) ha significado una mejora significativa en el diagnóstico de la toxoplasmosis. Una amplia variedad de blancos y juegos de cebadores son utilizados y solo se han realizado algunos estudios comparativos, mostrando una utilización preferencia del gen B1 y la secuencia repetitiva de 529 pb. Sin embargo, los resultados de comparación de ambas secuencias no son concluyentes para la selección preferencial de una. Objetivo: El objetivo de este trabajo fue diseñar una PCR múltiple que permita detectar simultáneamente ambos marcadores. Materiales y métodos: Para diseñar el sistema de PCR múltiple, fueron utilizados dos juegos de cebadores que amplifican regiones específicas dentro de la secuencia del gen B1 y el elemento repetitivo de 529pb. Luego de la optimización de las condiciones de reacción, se determinó la sensibilidad y especificidad diagnóstica del sistema así como la utilidad de la PCR múltiple para detectar el ADN de Toxoplasma. gondii en cepas de referencia del parasito y 70 muestras de sangre de pacientes sida con y sin Encefalitis por T. gondii (ET). Resultados: La sensibilidad analítica de la PCR múltiple evidenció un patrón de amplificación a muy bajas concentraciones de parásitos. Por otro lado, la sensibilidad diagnóstica fue del 86,6% mientras la especificidad diagnóstica fue del 100%. Una de las muestras fue positiva solo a uno de los marcadores en la PCR múltiple (gen B1). Conclusiones: La utilización de la PCR múltiple evidenció ser un ensayo rápido, suficientemente sensible, altamente específico y con ventajas económicas en relación a realizar ensayos independientes, PCR en tiempo Real o PCR anidada.